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液相色谱柱的分类

浏览次数: 日期:2015-11-29 15:17:02

一、色谱柱基本知识

  色谱是一种分离分析手段,分离是核心,因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等,其粒度一般为3,5,7,10um等,柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析,只要500即可;对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子,因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

  柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到最佳效率,除柱外死体积要小外,也要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

 

1.柱的构造

  色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成,压力不高于70Kg/cm2时,也可采用厚壁玻璃或石英管,管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效,减小管壁效应,不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度,其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的,用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板,是烧结不锈钢或钛合金,孔径0.2-20um(5-10um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出,柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定,目的是为了避免管壁效应。

2.柱的发展方向

  因强调分析速度而发展出短柱,柱长3~10cm,填料粒径2~3um。为提高分析灵敏度,与质谱(MS)联接,而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱(MICROBORE)。细管径柱的优点是:①节省流动相;②灵敏度增加;③样品量少;④能使用长柱达到高分离度;⑤容易控制柱温;⑥易于实现LC-MS联用。

  但由于柱体积越来越小,柱外效应的影响就更加显著,需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测),更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出1~100ul/min的低流量,进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因进样量小,要求高灵敏度检测器,电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。

3.柱的填充

  色谱柱的性能除了与固定相性能有关外,还与填充技术有关。在正常条件下,填料粒度>20um时,干法填充制备柱较为合适;颗粒<20um时,湿法填充较为理想。填充方法一般有四种:①高压匀浆法,多有用于分析柱和小规模制备柱的填充;②径向加压法,Waters专利;③轴向加压法,主要用于装填大直径柱;④干法,柱填充的技术性强,大多数实验室使用己填充好的商品柱。

  必须指出,高效液相色谱柱的获得,装填技术是重要环节,但根本问题还在于填料本身性能的优劣,以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。

二、液相色谱柱规格

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类

①常规分析柱(常量柱),内径2~5mm,柱长10~30cm;

②窄径柱(narrowbore),内径1~2mm,柱长10~20cm;

③毛细管柱(又称微柱microcolumn),内径0.2~0.5mm;

④半制备柱,内径>5mm;

⑤实验室制备柱,内径20~40mm,柱长10~30cm;

⑥生产制备柱内径可达几十厘米。

色谱柱了解

  1)平均颗粒度,颗粒度分布颗粒度(dp)越小:柱效越高(传质好,涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布

  颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)

  颗粒形状球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀

  无定型:柱床结构不均匀流动相线性速度不均匀,谱带扩展

  2)键合相化学

  1.影响化合物的分离度

  2.不同键合相对不同种类的化合物分离不同

  3.可能导致色谱的分离机理不同如:C18、C8、CN

  3)含碳量

  1.含碳量越高,k‘值越大(固定相传质效应增加)

  2.高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离、水解稳定性好,重现性好、有利于极性化合物的拖尾改善

  3.低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物、降低溶剂损耗、填料的端基封口、封口残余硅羟基、减少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量(0.1%-1%)

  不同色谱柱的含碳量如下所示:

  4)填料的端基封口

  封口残余硅羟基、减少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量(0.1%-1%)

  5)硅胶的活性

  主要影响碱性化合物的保留行为:k',生产硅胶时处理温度不同,硅胶活性也不同,是选择性差异的主要来源,硅胶的杂质含量,重金属含量低,硅羟基活性小,拖尾减小,是色谱柱质量好坏的重要标志,填料的稳定性,硅胶填料,pH:2-8,聚合物填料,pH:2-12,pH值小于2时,键合相水解,液相色谱法能否将某一样品完全分离,主要取决于色谱柱的选择性和柱效,这在很大程度上取决于固定相的选择是否适当。

  6)色谱柱的规格:内径、检测的灵敏度、样品的容量

  长度、分离度,理论塔板数、速度、样品的容量、检测的灵敏度

  7)柱性能评价:购买的色谱柱,使用前都要对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下(样品、流动相、流速、温度)下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性,或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时,还要注意柱外效应是否有变化。

  一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数,如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。

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