导读

        随着生物制药的快速发展及监管部门对生物药的要求越来越高,使得生物制药的分离纯化难度越来越大。层析技术由于具有较高的分离纯化效率且应用条件温和,在分离纯化过程中容易保持目标分子的生物活性,因此层析技术已成为生物制药最重要的纯化工具。层析介质制备技术难度大,门槛高,目前主要由美国GE、日本Tosoh 及德国Merck 等少数公司垄断,其中美国GE占全球市场85%以上。中国在高性能层析介质方面长期依赖进口。纳微通过10年持续不断的创新开发出世界领先的单分散高效层析介质的制备技术,成为全球单分散层析介质的最多品种规格的生产厂家,产品包括反相、离子交换、疏水、Protein A 亲和层析介质等,可以满足实验室的分析检测和工业化分离纯化的需求。
 

一、背景介绍

         基因工程、细胞工程以及酶工程为代表的现代生物技术的迅速发展,使生物制药获得前所未有的发展机遇,2015年生物制药的市场接近2000亿美元。生物制药的生产一般可分为上游发酵过程和下游纯化分离过程,因此如何经济、高效的从复杂组分中浓缩、分离和纯化目标生物分子已成为全球生物药生产的技术瓶颈。在蛋白类生物药生产过程中,分离成本可占总生产成本的50~80%,分离纯化技术还对生物药的分子形态、收率、质量和成本具有关键作用。另外随着生物药的日益发展其结构越来越复杂,同时监管部门对生物药的纯度要求越来越高,使得生物制药的分离纯化难度越来越大。由于生物大分子具有结构复杂、稳定性差、浓度低等特点,传统重结晶、精馏等小分子药物纯化方法不能满足生物大分子的分离纯化。由于液相色谱或层析技术具有较高的分离纯化效率,且条件温和,在分离纯化过程中容易保持目标分子的生物活性,因此层析技术已成为生物制药重要的纯化工具。层析介质是生物制药分离纯化系统的心脏,分离效果很大程度上取决于层析介质;用于生物制药分离纯化的层析介质对材料组成、粒径大小、形态、均匀性、孔道结构、表面功能基团及机械强度都有严格的要求。由于层析介质制备技术难度大、门槛高等因素,目前主要由美国GE、日本Tosoh 及德国Merck 等少数公司垄断,其中美国GE占全球市场85%以上,而中国市场在高性能层析介质方面长期依赖进口。  

二、生物层析介质的性能

        理想的层析介质需要满足多方面的要求:第一,对目标生物分子分离选择性好, 分辨率高;第二,层析介质的非特异性吸附低,回收率高, 同时在分离纯化过程中 可保持生物分子结构及生物活性;第三,介质要求有较高的有效比表面积及孔径大小,以满足生物分离纯化对高载量的需求;第四,介质基质及表面功能基团化学稳定性高,在分离纯化过程中没有脱落。并可在宽pH 范围使用,可在线清洗;第五,层析介质的机械强度要求较高,在重复装柱的过程中不容易破碎,可耐受一定的压力和流速以满足生产效率的要求;第六,层析介质粒径分布窄,具有完美的球型;第七,层析介质产品性能要稳定,批与批次重复性好;第八,层析介质的性价比要高,可降低生物制药成本。
用于生物大分子分离纯化的层析介质根据材料的组成可分为两大类: 第一类是天然碳水高分子改性层析介质,包括改性葡聚糖、琼脂糖和纤维素等;第二类是合成高分子层析介质,包括交联聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇等。

三种常见的生物大分子分离纯化层析介质
 
        天然碳水高分子改性层析介质由于亲水性好,生物分子兼容性好,在分离纯化过程中容易保持生物大分子的生物活性,因此早先被用于生物大分子的分离纯化,也是目前使用较广泛的生物分离纯化介质。天然碳水高分子改性层析介质常称为软胶,其缺陷是机械强度差,装填的柱床高度及耐受压力和流速都有一定的局限性,因此单位体积的介质纯化目标的生物分子效率较低,而且介质只适合装在矮胖的柱子中。另外软胶在固态下没有孔隙,只有在水溶液介质里溶胀下高分子链舒展开形成网状孔隙,生物分子在网状孔隙结构的软胶中扩散速度较慢,因此流速对软胶的动态载量影响较大,流速快时,分子来不及扩散到微球介质里而沿球与球之间的孔隙往下流动,因此在高流速下,流穿较快,动态载量较低。而合成高分子层析介质(也称为硬胶)不仅具有较强的机械强度,而且其孔道结构与软胶结构有很大的差别,即使在干燥状态下,硬胶也有固有的孔隙,硬胶的孔隙是由纳米粒子堆积成的。分子在其像山洞式的孔隙中传递比较快,因此即使是较高流速下载量也较高。另外由于硬胶是有高度交联的聚合物组成的在水溶液中溶胀小,因此柱床稳定,而软胶在干澡状态和溶胀状态下体积会相差几倍, 软胶的柱床高度也随压力增加而降低。

硬质聚苯乙烯(a)与软胶琼脂糖(b)为基质的层析介质SEM对比图
 
        如下图Uni®Mab 和MabSure 是分别以硬胶聚丙烯酸酯为基质和软胶琼脂糖(Agarose)为基质的Protein A 亲和介质的动态载量在不同保留时间的区别。从图中可以看出,虽然两者静态载量差距不大,但以硬胶为基质Uni®Mab层析介质的动态载量在高流速下比软胶为基质MabSure的动态载量却高很多。

纳微硬质Uni®Mab与国际知名厂商琼脂糖基质的Protein A亲和层析介质载量对比图
 
        硬胶还具有极高的化学稳定性,同时在生产过程中易于控制介质的形态、大小、粒径分布及孔道结构,因此被越来越多地用于生物制药的分离纯化介质,其代表性产品是GE SOURCE 和纳微Nano系列高效层析介质,这两类层析介质都是以高交联聚苯乙烯为基质的单分散多孔微球,并通过表面亲水改性及功能化制备而成,与碳水高分子改性层析介质相比,具有粒径小、粒径分布窄、机械强度高、在高流速下也有较高的载量等特点,可满足高效层析系统的需求,因此装成的柱子具有高柱效、高分辨率、高载量、高流速、高选择性等优点。另外由于其基质由聚苯乙烯组成,具有极强的化学稳定性和极长的寿命等特点,是比较理想的层析介质,因此这些层析介质已越来越多地用于生物制药的精细分离纯化。
软胶与硬胶压力与流速的关系

三、单分散高效层析介质的制备技术

       GE 是全球第一家提供商业化的单分散聚苯乙烯层析介质,其商品名是SOURCE。但GE公司本身并不具备生产单分散聚苯乙烯多孔微球的技术,GE单分散聚苯乙烯微球由Dynal 公司独家提供。 Dynal 公司单分散聚苯乙烯多孔微球的制备方法是利用挪威科学家Ugelstand等人发明的多步种子聚合法制备(US Patent No.4530956)。
 

Ugelstad 多步种子溶胀聚合制备单分散性微球的示意图
 
        Ugelstad 种子法可以直接用来制备一定粒径范围的单分散聚合物微球,克服了传统悬浮聚合法合成的微球粒径分布宽(见下图),需要经过复杂的分级筛分工艺才能获得满足窄分布应用要求的层析介质。而分级筛分方法工艺复杂、周期长、产率低,并且会产生大量的不合格微球并造成对环境的污染。


悬浮聚合法合成“Gaussin”分布微球的示意图

        Ugelstad的多步种子聚合技术也存在许多缺点:如种子需要有机溶剂活化,活化周期长,工艺复杂,生产周期长,大规模生产难度大等特点,并且制备的微球粒径和孔径范围有局限性。纳微发明的边溶胀边聚合种子制备微球技术克服了现有Ugelstand多步种子聚合法制备单分散微球的缺点。可用于精确制备大小可控,尺寸均一,单分散聚合物微球;且反应周期短;工艺简单,适用于大规模生产,还容易控制微球材料组成、形态、孔径大小和比表面积等。

边溶胀边聚合种子制备单分散性微球的示意图
 
        边溶胀边聚合种子技术制备的聚苯乙烯/二乙烯基苯微球可直接用于蛋白分离的反相介质,这些微球如果要用于离子交换、分子筛等分离方式,一般要对微球表面进行亲水层修饰或表面功能化。这些表面修饰和功能化的主要目的就是引入具有一定密度的功能基团,降低蛋白与微球表面的非特异吸附,提高分离的效果和选择性,保持蛋白的活性及提高蛋白的回收率。这些功能团还必须具有化学和pH稳定性。用作分离介质的聚合物微球尤其是聚苯乙烯微球为了保持一定的机械强度,一般都是高度交联,因此化学惰性较高,引入的功能团密度有一定的难度。纳微通过表面可控表聚合的方法在聚合物微球表面均匀涂敷一层厚度可控的亲水层,然后通过化学反应引人高密度的功能团。使所获得的蛋白质微球分离介质具有高分辨率、高载量、高流速、高选择性和较底的非特异性吸附等优点,是理想的蛋白分离介质。纳微已成功地生产出高性能离子交换、疏水及亲和层析介质。

聚苯乙烯表面功能化制备各种层析介质的示意图

四、纳微单分散聚合物层析介质的优势

        纳微利用领先的单分散聚合物微球专利制备技术成功地开发出全球最多品规的单分散高效聚合物层析介质,成为世界单分散聚合物层析介质的领导者。纳微生产的单分散聚合物层析介质在选择范围,规模化程度及稳定供应方面与GE SOURCE 系列产品相比具有明显优势:
1.  更大粒径范围的选择
       GE SOURCE 层析介质的主要粒径规格有3、5、10、15、30微米;而纳微单分散聚苯乙烯微球的常规粒径规格有2、3、 5、10、15、20、30、40、50微米。对于传统悬浮聚合法合成多分散微球属于Up-Down 模式(由大往小),微球直径越大越容易做,而种子法合成单分散微球则是Bottom-Up 模式(由小往大)因此球的尺寸越大越难做,由于Ugelstad的多步种子聚合技术用于生产微球时需要多步溶涨且时间长,在溶涨过程中,颗粒越大越不稳定,因此利用该方法生产粒径大的微球难度越大,目前GE能提供商业化单分散层析介质最大的粒径尺寸只有30微米,而纳微商业化的单分散聚苯乙烯微球最大的粒径可以达到50微米,单分散聚甲基丙烯酸酯微球则可达到80微米。 因此纳微先进的单分散微球制备技术为客户提供更大粒径范围的选择,可以满足客户更广泛的需求。

不同粒径单分散色谱填料扫描电镜图
2.  更多材质种类的单分散介质
       目前GE 提供的SOURCE 系列单分散聚合物层析介质只有聚苯乙烯一种基质,而聚丙烯酸酯为基质的层析介质由于亲水性能好,表面易于修饰及功能化因此被广泛地用于生物医药分离纯化,如日本Tosoh 公司生产的Toyopearl 系列层析介质就是以聚丙烯酸酯为基质,但所有Toyopearl 系列层析介质都是用传统悬浮聚合法合成的,粒径分布较宽。纳微不仅可以提供SOURCE 类聚苯乙烯单分散层析介质,也可以提供Toyopearl类聚丙烯酸酯单分散层析介质,是目前提供商业化单分散聚丙烯酸酯层析介质的公司。
3.更多的孔径范围选择
       介质的分离性能除了与粒径大小和分布有关外,与孔径的结构和大小也有极大的关系。孔径的结构和大小不仅影响层析介质的载量还会影响它的选择性因此控制孔径结构和大小是生产高效介质的关键技术之一。GE SOURCE 层析介质的孔径只有一种1000 Å选择,这种孔径的介质比较适合于蛋白类大分子的分离纯化,但对于中小分子如多肽类就不是很合适。因为同样的孔容积条件下,孔径越大,比表面积越小,而比表面积大小与载量有关,有效比表面积越大载量越大。因此对于多肽或小分子选择小孔径比较合适。纳微常规孔径可选择100、300、500、1000 Å,也可根据客户的需求定制特殊孔径的层析介质如4000 Å孔径的介质。

不同孔径色谱填料的扫描电镜SEM图
4.  更大的生产规模
       纳微已建成世界最大的单分散层析介质的生产基地,每个批次可生产500升单分散层析介质,月生产量15000升。
5.  提供更多的定制化和应用开发服务
     纳微可根据客户需求提供定制化高效层析介质,并为客户开发分离纯化解决方法。

五、应用案例

         纳微层析介质在分离生物分子(如蛋白质、核酸、多肽、多糖等)方面,表现出更高的分辨率、更高的效率和回收率。下图为纳微NanoSP离子交换层析介质对蛋白的分离效果图。(色谱柱: 4.6 mm I.D × 250 mm, PEEK.;样品: 1. Ribonuclease A (10 mg/mL) 2. Cytochrome C (4 mg/mL) 3. Lysozyme (2.5 mg/mL);进样体积: 20 μL;缓冲液A: 20 mM PBS (pH 6.8)  缓冲液B: 20 mM PBS + 0.5 M NaCl (pH 6.8);梯度: 10CV linear gradient from 100% A to 100% B;流速: 1.0 mL/min (360 cm/h);检测器: AKTA Purifier (UV @ 280 nm) )

纳微NanoSP-10L对蛋白的分离效果图

六、产品目录


七、苏州纳微科技有限公司简介

          苏州纳微科技有限公司是专门从事高精度、高性能和高附加值纳微米球材料的研究、生产、销售的国家高新技术企业。已申请25项纳微米球材料制备和应用发明专利。公司可提供从5 nm到1000 μm粒径范围的任意大小单分散纳微米球。纳微生产的微球不仅具有精确的粒径大小、高度的粒径均一性,而且可以对微球形态、孔径结构、比表面积及表面功能基团进行调控。微球基质涵盖了从无机氧化物(如氧化硅, 四氧化三铁等)、到有机高分子(聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯等)及高分子/无机复合材料,可以满足实验室科研和大规模制造的各种需求。
纳微是一家可大规模制备单分散多孔二氧化硅色谱填料微球的公司,也是目前能提供多品规的单分散聚合物分离介质微球的公司。纳微凭借其先进的纳微米球制备技术,已赢得了国内上百家医药企业的认同,同时已向欧洲、美国、韩国等大型药企出口累计上万升高性能填料,改变了我国单向进口色谱填料的被动局面。
       纳微拥有现代化的生产设施、先进的分析仪器以及可靠的质量控制体系,可以确保产品的质量、良好的批次间重复性和大规模生产能力。纳微已通过ISO9001:2008质量管理体系认证。目前已在园区纳米城建成超过13000平米现代化生产厂房和研发中心,现有员工120人,研发团队近40人,其中10人具有博士学位,包括5位在美国学习和工作多年的科学家。
纳微已承担国家发改委生物医药发展专项、国家科技型中小企业技术创新基金、国家十二五科技支撑计划项目、江苏省成果转化专项资金、江苏省科技支撑计划等多项国家省市级科研项目;分别荣获中国侨界贡献奖、江苏五一劳动奖章、苏州市科学技术进步奖、苏州市十佳魅力科技人物;纳微已建成苏州市纳微米材料工程技术研究中心、苏州市企业技术中心、苏州市工业园区博士后创新实践基地等。
       纳微科技秉持“以创新赢尊重得未来”的理念,凭借持续不断的创新,成为全球纳米微球技术的领跑者, 并将微球的应用不断地拓展到更多的应用领域。 纳微科技的使命就是通过创新来赋予纳米微球新的光、电、磁等各种功能, 使它为人类创造无限可能,以满足生物制药,光电显示,医疗诊断,食品安全检测等产业的关键材料和技术的需求。

纳微研发及生产大楼