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多肽物质分离与分析方法研究进展

浏览次数: 日期:2017-05-24 16:33:42

文章来源:小木虫论坛

 

多肽类化合物广泛存在于自然界中,其中对具有一定生物学活性的多肽的研究,一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的,生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展,从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用,不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。

 

分离方法

采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括:盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化,同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段,如层析、电泳等。

 

1、高效液相色谱(HPLC

HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其他化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

 

1) 反相高效液相色谱(RP-HPLC

结果与保留值之间的关系:利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在2~20氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在10~60氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间。而含5~25个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。

肽图分析(Peptide Mapping):肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点,使用专一性较强的蛋白水解酶[一般为肽链内切酶(endopeptidase)]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断,通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。肽图分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质,通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素(rhGH)的肽片断,成功获得了人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得,并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图,便于鉴定分析。此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。

 

2) 疏水作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography,HIC)

HIC是利用多肽中含有疏水基团,可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的,其比RP-HPLC具有较少使多肽变性的特点。利用HIC分离生产激素(GH)产品的结构与活性比RP-HPLC分离的要稳定,活性较稳定。Geng等利用HIC柱的低变性特点,将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ,通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子(EGF)也利用HIC纯化到了,均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能达到这一要求。

 

3) 分子排阻色谱(Size-Exclusion chromatography,SEC)

SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质,特别对一些较大的聚集态的分子更为方便。如人重组生长激素(hGH)的分离,不同结构、构型的GH在SEC柱上的分离行为完全不同,从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体。利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法,此PEG具有半衰期长、作用强的特点。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。

 

4) 离子交换色谱(Iron-Exchange chromatography,IEXC)

IEXC可在中性条件下,利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类,还有一些新型树脂,如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的分离分析研究中,对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多,不同的多肽分离条件有所不同,特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子交换柱层析法,探讨分离牛碳酸酐酶异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件,获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。

 

5) 膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)

CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统,一般有去垢剂(如,SDS)溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白,并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团(P-端),又具有阳离子钙(C-端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换,从而达到分级分离的目的。

 

6) 高效置换色谱(High-Performance Displacement Chromatography,HPDC)

HPDC是利用小分子的高效置换剂来交换色谱柱上的样品,从而达到分离目的。它具有分离组分含量较少成分的特性。利用HPDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素(rHG)。在研究非毒性交换剂时Jayarama发现硫酸化葡聚糖(Detran Sulfate,DS)是对β-乳球蛋白A和B的良好置换剂,一般DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜。研究表明置换剂的相对分子质量越低,越易于与固定相结合,因此在分离相对分子质量小的多肽时,需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。

 

7) 灌注层析(Perfusion Chromatography,PC)

PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法,固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。目前市场上可供应的PC固定相种类较多,适合于不同分子量的多肽分离使用。

 

2、亲和层析(Affinity Chromatography,AC)

AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲合性而分离物质的层析方法。自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来,在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合,如,抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等。对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和,这些配基有天然的,也有根据其结构人工合成的。Patel等人利用一系列亲合柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。

固定金属亲和层析(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)是近年来发展起来的一种亲和方法。其固定相基质上鳌合了一些金属离子,如,Cu2+、Ni2+、Fe3+等,此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽,特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上,纯化效果较好。其中胰岛素样生长因子(Insulin-Like Growth Factor,IGF)、二氢叶酸还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。

Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法,利用反义多肽作为配基,这种多肽是由反义DNA表达产生,其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性,如,Arg加压素受体复合物,已用此法分离得到。DNA与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上,将样品蛋白或多肽从柱中流过,与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。

 

3、毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)――分离分析方法:

CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的,其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽,使电泳效率提高了几十倍。此技术从80年代以来发展迅速,是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。CE根据应用原理不同可分为以下几种;毛细管区带电泳(Capillary Zone electrophoresis,CZE)、毛细管等电聚焦电泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)、毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)和胶束电动毛细管层析(Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography,MECC)等。

 

1) 毛细管区带电泳(Capillary Zone electrophoresis,CZE)

CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电荷不同,且分离效果只由带电性决定,比传统凝胶电泳更准确。目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛吸管硅胶柱上的硅醇发生反应,影响峰形与电泳时间,针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进,如,调节电泳液的pH值,使与硅醇反应的极性基团减少;改进毛细管柱材料的组成,针对多肽性质的不同采取不同的CZE柱来分离。Issaq等利用CZE方法研究分离5个含9个氨基酸残基的小肽,确定了小肽分析的基本条件,即在低pH条件下,缓冲液中含有一定浓度的金属离子,如,Zn2+等,此时分离速度快而且准确。

 

2) 毛细管等电聚焦电泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)

由于不同的蛋白、多肽的等电点(PI)不同,因此在具有不同pH梯度的电泳槽中,其可在等电点pH条件下聚集沉淀下来,而与其他肽分离开来。CIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多,主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离,如对rHG不同异构体分离。由于在CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。

 

3) 毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)

CGE是基于分子筛原理,经十二烷基磺酸钠(SDS)处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。目前,又有一种非交联、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽类物质的分离分析,此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离。这种凝胶易于灌注,使用寿命长,性质较为稳定。

 

4) 胶束电动毛细管层析(Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography,MECC)

MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂,如,SDS,使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。特别对一些小分子肽,阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束,从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质,可使含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用,从而利用疏水作用使多肽得到分离。

 

4、多肽及蛋白质分离工程的系统应用

以上提到的分离多肽的技术在实际应用过程中多相互结合,根据分离多肽性质的不同,采用不同的分离手段。特别是在后基因组时代,对于蛋白质组深入的研究,人们对于分离多肽及蛋白质的手段不断改进,综合利用了蛋白质和多肽的各种性质,采用包括前面提到的常规蛋白多肽提取方法,同时利用了高效液相色谱,毛细管电泳,2-D电泳等手段分离得到细胞或组织中尽可能多的蛋白多肽。在蛋白质组学研究中系统应用蛋白和多肽分离鉴定的技术是实现蛋白质组计划的关键。其中电泳技术在此项研究中即是分离手段也是分析方法之一。特别是以下提到的质谱技术的发展,大大的提高了蛋白多肽类物质的分析鉴定的效率。

 

分析方法

1、质谱分析(Mass Spectrometry,MS)

MS在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用,特别是在分离纯化后的在线分析中,MS的高灵敏性、快速性特别适合多肽物质分析鉴定。其中连续流快原子轰击质谱(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment,cf-FAB)和电雾离子化质谱(Electrospray Ionization,EIS)是近几年发展起来的新方法。

 

1) 连续流快原子轰击质谱(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment,cf-FAB

cf-FAB是一种弱离子化技术,可将肽类或小分子量蛋白离子化成MH+或(M-H)形式。主要应用于肽类的分离检测,其具有中等分辨率,精确度大于±0.2amu,流速一般在0.5-15μl•mL-1。在测定使流动相需加0.5%~10%基质,如,甘油和高有机溶剂成分,使样品在检测探针处达到敏感化。cf-FAB常与HPLC、CEZ等方法结合使用达分离、分析目的,许多多肽的cf-FAB分析方法已经建立,并得到很好的应用,如,Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。证明L-Pro在保持小肽构相稳定性,连接分子方面具有重要意义。

 

2) 电雾离子化质谱(Electrospray Ionization,EIS)

EIS可产生多价离子化的蛋白或多肽,允许相对分子质量达1×105的蛋白进行分析,分辨率在1500~2000amu,精确度在0.01%左右。EIS更适合相对分子质量大的蛋白质的在线分析,且需要气化或有机溶剂使样品敏感化。利用EIS与HPLC联合分离分析GH和血红蛋白均获成功,其也可与CEZ联合应用。

 

3) 基质辅助激光解析/离子化——飞行时间质谱(Matrix-associatedlaser dissociation/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中精确测定相对分子质量的手段,特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定,灵敏度和分辨率均较高。它是目前蛋白质组学研究的必备工具。同时结合液相色谱的联用技术可以高效率的鉴定多肽物质。特别是当各种原理的质谱技术串联应用时,不但可以得到多肽的相对分子质量信息,还可以测定它的序列结构,此项技术将在未来蛋白质组学研究中起到决定性作用。

 

2、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)

NMR因图谱信号的纯数字化、过度的重叠范围过宽(由于相对分子质量太大)和信号弱等原因,在蛋白、多肽物质的分析中应用一直不多。随着二维、三维以及四维NMR的应用,分子生物学、计算机处理技术的发展,使NMR逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR可用于确定氨基酸序列、定量混合物中的各组分组成含量等分析中。但要应用于蛋白质分析中仍有许多问题需要解决,例如,如何使分子量大的蛋白质有特定的形状而便于定量与定性分析,如何减少数据处理的时间问题等。这些问题多有不少学者在进行研究。虽然在蛋白质分析中应用较少,NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用的,可以克服上述蛋白质分析中的缺点而达到快速准确分析的目的。

 

3、其他

除上述方法之外,氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、场解析质谱、IR、UV光谱、CD、圆而色谱、生物鉴定法、放射性同位素标记法及免疫学方法等都已应用于多肽类物质的结果鉴定、分析检测之中。

以上简要的介绍了近几年多肽类物质分离、分析的常用方法及最新研究方向。随着科学技术水平的不断发展,会有许多更新的分离分析手段不断涌现,因此这一领域的研究具有广阔的前景。

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