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漫谈治疗性抗体的聚集(一)机理和聚合体的特征

浏览次数: 日期:2017-05-03 16:33:06

抗体聚集(aggregation)是一个关于蛋白质折叠的问题,首先我们了解一下蛋白质是如何被细胞生产出来的。

 

1. 蛋白质是如何折叠的

一个基因通过转录,翻译生成一条多肽链,多肽链的氨基酸残基序列称为一级结构;我们知道物质世界中,在一个独立的体系中,物质倾向处于自体的最低能量稳定态,这是物质的一种内生秉性。蛋白质也是一样的,当多肽链合成出来后,它立即折叠成规则的结构,以降低自体能量。多肽链中的疏水氨基酸残基在水分子的作用下,通过疏水相互作用向内折叠,而亲水氨基酸残基和水分子相互作用折叠在外面,相应的氨基酸残基通过形成分子内氢键被“固定”住,形成α-helix和β-sheet结构,被称为蛋白质的二级结构;在二级结构的基础上,在氢键、范德华力等作用力下, 蛋白质进一步折叠形成能行使某一单独功能的结构功能域,称为蛋白质的三级结构;由一个或数个结构功能域组成的具有特定功能的天然结构,称为蛋白质的四级结构。

 

蛋白折叠的过程

 

图片来源:Wikipedia

 

蛋白质折叠是一个非常复杂的过程,中间会形成很多不稳定的过渡态折叠,这些不稳定的过渡态折叠最终会折叠成为能量最低的天然结构蛋白质。多肽链折叠成为有功能的天然结构蛋白质是一个非常快速的过程,大约需要1~100微秒的时间。

 

蛋白折叠过程中自由能的变化

 

 

在细胞内,绝大多数的蛋白质可以自发折叠和拼接成天然结构,或者与配体相互作用形成稳定结构;约20%的蛋白质不能自发折叠,需要在分子伴侣的帮助下折叠和拼接成天然结构。

 

蛋白合成过程中,基因转录,mRNA加工和翻译等过程发生遗传突变或故障,以及热应激、渗透压或氧化应激等都可能引起新合成多肽链的错误折叠,通常情况下,大多数错误折叠蛋白质(misfolded protein) 会被泛素化,然后被蛋白酶降解;而另一些错误折叠蛋白会聚集形成蛋白聚集体(aggregates)或淀粉样纤维(amyloid fibrils),被储藏在细胞的特定部位。这些蛋白聚集体或amyloid fibrils与多种疾病的致病机制密切相关, 如神经退行性疾病Alzheimer。

 

蛋白的错误折叠

 

 

2: 抗体聚合体是如何形成的?

在生物体内,蛋白质的聚集是由于蛋白质的错误折叠所引起的。当然,在抗体的细胞内合成过程中也会被错误折叠形成抗体聚集体, 为什么抗体的错误折叠能引起抗体的聚集?

 

抗体聚集的原因:

抗体(IgG)是由12个相对独立的结构功能域组成,每个功能域结构的显著特征是一个特殊的“三明治”状,由反向平行的3~4对β-sheet片层结构构成。以IgG的轻链V区结构域为例,它含有3对β-sheet片层组成类似三明治的夹心,有一个疏水的内部,疏水相互作用稳定了β-sheet片层间的联系。另外,通过分子内氢键和共价二硫键也加强了β-sheet片层结构间的稳定性。

 

 抗体(IgG)的三维结构

 

绝大多数能形成聚合体或amyloid fibrils 的蛋白质都含有大量的β-sheet二级结构,比如引起Alzheimer的Aβ-fiber蛋白。β-sheet主要通过疏水作用和氢键形成稳定的结构,疏水相互作用是一种长距离相互作用,所以较氢键等近距离相互作用作用力要小很多。当蛋白的氨基酸发生突变或者蛋白结构发生错误折叠,β-sheet结构中的疏水基团就可能暴露出来,而蛋白质分子间通过疏水残基间的相互作用可以发生蛋白质的聚集来阻止疏水基团暴露在水环境中。

 

许多研究表明,蛋白质的疏水性是驱动蛋白质聚集的主要原因,而抗体含有大量的疏水性β-sheet结构,所以说,抗体的特殊结构特征是抗体聚集的内在原因。

 

抗体蛋白聚集的过程:

首先是正常折叠的抗体蛋白单体因为内在或外在的压力引起部分结构的变化或解体形成部分(或错误)折叠蛋白单体,使得疏水结构暴露出来,数个抗体分子通过疏水作用形成同源或异源的寡聚体。这些寡聚体进一步形成“核Nuclei”, “核”含有特殊的疏水结构可以“催化”抗体单体和寡聚体快速的结合到“核“上,并产生新的“核”来“催化”抗体聚集体的延长。随着抗体聚集体的延长,最终形成可溶的抗体聚集体以及不可溶聚集体。这些抗体聚集体的大小可以小到几十纳米,也可以大于数百微米。另外,由于抗体结构的复杂性,每一种抗体形成的聚集体都是一种混合物。

 

抗体蛋白的聚集模型

 

图片来源:Christopher J. Robert(2014

 

3: 环境压力对抗体蛋白聚集的影响

抗体蛋白在细胞发酵,纯化以及储存过程中都会引起抗体的非正常聚集效应。工业抗体药物的生产是一个非常复杂的过程,很多环境因素都会影响抗体药物聚集体的形成,比如细胞发酵过程中的搅拌速度和温度;纯化过程中的缓冲液离子浓度和pH的变化;储存过程中的液固/气液界面和氧气的接触等。例如:极端温度可以减弱蛋白氨基酸残基之间的非共价相互作用。溶液pH变化可以通过改变氨基酸基团的质子化态,引起蛋白分子内/间基团间的非共建相互作用的改变,从而造成蛋白的高级结构的解体。环境压力引起抗体结构的变化是抗体聚合体的形成开端。

 

已经有数千篇关于环境压力如何影响抗体聚集体形成的文献发表。Marisa K.Joubert和同事研究了加热,金属离子,搅拌,交联,pH变化以及冷冻融化对特定抗体聚合体形成的影响。它们用上述方法处理抗体样品后,统计了2-150μm 抗体聚合体的分布和数量,在所有的样品中2~5μm 较其他较大的聚集体是最多的;相对于其他处理方法,搅拌,金属离子和加热处理产生的聚集体最多,而且2~150μm中各个区段都有不同大小的聚集体产生。

 

另外,他们检测了将不同方法处理的样品进行了离心,获得了可溶和不可溶的聚集体样品,并用傅立叶红外色谱(FTIR)研究了二级蛋白结构。结构显示:和对照相比,所有处理的样品的二级结构都发生了变化,其中90加热处理和磁力搅拌处理的可溶聚集体的二级结构变化较大,其他处理方式的的二级结构变化相对不是特别显著。所有不可溶的聚集体的二级结构变化都很显著。

 

每一种抗体的结构都有各自的结构差异,因此,用相同的处理条件,抗体聚集体的特征是不一样的。

 

 不同处理条件下抗体样品聚集体大小的分布和数量变化

 

图片来源:Marisa K. Joubert(2011

 

不同处理条件下抗体样品中聚集体二级结构的变化

 

图片来源:Marisa K. Joubert(2011

 

小结:抗体的特殊结构是抗体产生聚集体的内在原因,也就是说抗体的聚集是不可避免的。我们通过对抗体聚集机理的不断深入认知,通过抗体结构设计和科学的调控抗体蛋白生产及使用过程中各个环境因素,最大程度的降低抗体聚集的可能性。

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