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重组蛋白的详细构建方法

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  • 来源:
  • 发布时间:2021-12-30 10:14
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【概要描述】  用重组DNA表达目的基因得到的蛋白质变成重组蛋白,在生物信号传递、药物研发和科学研究过程中发挥重要作用。先介绍一下重组蛋白的制作过程。

重组蛋白的详细构建方法

【概要描述】  用重组DNA表达目的基因得到的蛋白质变成重组蛋白,在生物信号传递、药物研发和科学研究过程中发挥重要作用。先介绍一下重组蛋白的制作过程。

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  用重组DNA表达目的基因得到的蛋白质变成重组蛋白,在生物信号传递、药物研发和科学研究过程中发挥重要作用。先介绍一下重组蛋白的制作过程。

  1.基因扩增

  (1)引物合成

  搜索目的蛋白的基因信息,结合蛋白的结构信息,选择片段或全长设计引物。注意尽量避开引物得分高的跨膜区和复杂的二级结构,一般是N端或C端,利用载体等信息,核酸序列的限制性位点。相关部门根据经验提出修改建议后,定稿提交给第三方公司进行引物合成。

  (2)基因克隆机的重组鉴定

  1)PCR

  根据蛋白的特异表达组织,选择特异的组织RNA用上述引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳后,根据分子量选择目标片段进行凝胶切割和回收。再次进行PCR扩增,获得大量DNA,并回收PCR产物。

  2)酶切和连接

  根据酶切位点,将目的PCR产物和相应的载体进行酶切,得到粘性端的DNA产物,然后进行琼脂糖凝胶电泳,根据目的条带大小选择相应的片段进行凝胶切割回收。以及将具有相同限制性位点的载体与DNA的片段连接。

  3)转化、挑菌、验证

  将连接的靶片段转化到感受态大肠杆菌中,并在LB平板上培养过夜。挑取平板上的斑块进行验证聚合酶链反应,并将聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。根据目的条带的大小,选择相应的菌液进行测序,测序正确后保存种子。

  2.蛋白质表达

  (1)蛋白质表达试验

  选择少量菌株进行培养,诱导表达,对表达的蛋白进行SDS-PAGE,根据目的条带的大小判断目的蛋白是否表达,表达成功后进行蛋白预扩增实验。

  (2)蛋白质扩增实验

  将小试成功表达的蛋白菌株在400-800 ml培养基中培养表达,进行SDS-PAGE。根据靶带的大小判断靶蛋白是否成功表达。预扩增实验成功后,进行进一步的蛋白质扩增实验。扩增实验在800-1600 ml培养基中培养,具体验证同上。

  3.蛋白质纯化

  因为载体上有他的标签,所以用镍柱纯化。部分蛋白质可能形成包涵体,纯化后的蛋白质将经过SDS-PAGE、BCA等分子量和纯度实验验证,纯度在95%以上。

  4.质量检查

  获得蛋白质后,将其冷冻干燥。冷冻干燥后,将通过常规蛋白质实验进行验证,通过测试后储存。


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