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提高单抗纯化产率,只有等高放大吗?

提高单抗纯化产率,只有等高放大吗?

【概要描述】UniMab填料为单分散PMMA微球基质键合耐碱性优化的rProtein A配基而制成的亲和介质,专门为提高抗体药物生产效率和降低批量成本而开发,满足工业化规模的单克隆抗体(mAb)以及含有Fc片段重组蛋白的大规模生产需求。

提高单抗纯化产率,只有等高放大吗?

【概要描述】UniMab填料为单分散PMMA微球基质键合耐碱性优化的rProtein A配基而制成的亲和介质,专门为提高抗体药物生产效率和降低批量成本而开发,满足工业化规模的单克隆抗体(mAb)以及含有Fc片段重组蛋白的大规模生产需求。

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纳微科技专为提高抗体生产效率开发的UniMab填料
UniMab填料为单分散PMMA微球基质键合耐碱性优化的rProtein A配基而制成的亲和介质,专门为提高抗体药物生产效率和降低批量成本而开发,满足工业化规模的单克隆抗体(mAb)以及含有Fc片段重组蛋白的大规模生产需求。拥有诸多优势:
 
UniMab的独特优势:单分散微球基质、高强度和短保留时间下的高动态载量
UniMab亲和层析介质相比市场上同类硬胶或软胶填料有独特性,“超常规柱高”之所以可惠及实际的抗体纯化工艺,须满足3个条件:一是微球基质的单分散性,纳微独立开发的单分散均一粒径的亲水PMMA微球,粒径50 μm,CV值小于5%,确保批次间重现性和峰形对称性;二是填料机械强度高,能承受更大压力(如:1MPa压力),才可装填至更大柱高;三是在更短驻留时间下具备高动态结合载量(DBC),比如2 ~ 4 min可达到35至45 mg/ml Gel的动态载量。纳微UniMab Protein A介质满足以上三个重要条件,即单分散微球基质、高强度和短保留时间下的高动态载量,因此在超常规柱高下它能发挥传统填料难以具备的优势。
 
 
软胶亲和填料(非单分散)和单分散UniMab亲和填料的微球形貌对比
 
UniMab Protein A层析介质在更短的驻留时间下的高动态载量
 
采用UniMab亲和填料用于抗体纯化的诸多价值:
UniMab填料应用于抗体纯化具备七大价值,是许多客户选择信赖该填料的根本原因。
 
 
自从1986年第一个抗体类药物莫罗单抗获批上市,1997年首个抗肿瘤抗体药物利妥昔单抗上市,三十多年来FDA已批准了67款治疗性抗体药。抗体药物的应用范围越来越广,抗体药物的市场容量不断攀升,从2012年的530亿美元扩容至2016年的880亿美元,中国单抗市场由2016年100亿元预计将增长至2022年的360亿元。2017年末,信达生物首个国产PD-1单抗的上市申请获得CFDA受理。随着抗体新药和仿制药不断增加规模产能,寻求下游分离纯化环节的经济性和高效性是必然趋势。
 
 
传统“等柱高放大理论”的局限性
传统的“等柱高放大”一直以来都有局限性,即通过增加层析柱的直径让柱床高度、线性流速与小试条件保持一致,但琼脂糖等软胶基质由于难以承受超过0.3MPa的压力,装填柱高被限制在10-20 cm,而层析柱床高度在10-50cm,利用率还有较大拓展空间。如果Protein A亲和填料被装填到30 cm以上且维持保留时间不变,能够极大提高单批次填料的生产效率和设备利用率,节约大量人力、物力及时间成本。单分散聚甲基丙烯酸酯材质(PMMA)的层析填料具有低反压与高强度耐压特性,UniMab填料就是基于此基架的抗体亲和填料,在4分钟保留条件下装填高度可至30cm以上。本文系统评估了UniMab填料在超常规柱高和等保留时间下的抗体分离纯化表现,为探索抗体纯化规模放大和效率提升提供了重要依据。
 
UniMab填料不同柱高的压力-流速曲线
采用超常规的柱高(>20cm),分别装到25cm、30cm、35cm和40cm,UniMab填料具有出色的压力和流速曲线,在50cm/h至1000cm/h的极宽流速范围内维持线性关系,这是琼脂糖或传统聚合填料难以媲美的动力学范围,体现了单分散填料的优异性能。
 
 
UniMab在极宽的范围内具有理想的压力-流速曲线
 
UniMab等保留时间放大的压力考察
为评价UniMab填料在不同柱高与放大规模下对单抗的纯化效果,实验中将填料分别装填至1mL、8mL和70mL的层析柱进行实验。结果显示即便在35cm的柱高条件下,层析柱的压力不高于0.35 MPa,远小于UniMab填料耐压上限(1MPa)。
 
 
UniMab等保留时间放大的纯化效果考察
实验采用单抗上清液(4.2g/l,已澄清)进行实验,层析柱为上述三组UniMab层析柱,纯化过程图谱如下。三组图谱的趋势基本相同,再进一步评价杂质去除效果以及回收率。
 
 
 
原液检测图谱和三组UniMab预装柱的抗体纯化图谱
(A:1mL规模Mab纯化;B:8mL规模Mab纯化;C:70mL规模Mab纯化
实验条件:ÄKTA Avant 25,ÄKTA Purifier 100,预装柱:UniMab,上样量:21mg/mL(抗体/填料),保留时间:4min,平衡液:20mmol/L PB, 150mmol/L NaCl, pH 7.2±0.1,清洗液:平衡液,洗脱液:0.1 mol/L 乙酸溶液,pH 3.6±0.1,CIP液:0.5 N 氢氧化钠溶液,收集:UV 280,按信号50mAu。
SDS-PAGE电泳检测发酵液上清和纯化洗脱液
(1:Mab发酵上清,2:1ml柱洗脱液,3:8ml柱洗脱液,4:70ml柱洗脱液)
 
            
 还原条件                                                                 非还原条件
 
 
SDS-PAGE检测UniMab不同柱高条件下的纯化效果
采用SDS-PAGE检测了单抗纯化前后的样品。实验表明,在还原条件和非还原条件下,目标抗体条带清晰,未发现杂蛋白条带,三种柱高条件结果一致,这对纯化工艺线性放大中确保工艺的可重复性和稳定性具有重要意义。
 
UniMab不同柱高纯化之后的(DNA、protein A、HCP)残留、收率和纯度
UniMab填料从1ml柱体积放大至70倍之后仍可保持一致的纯化效果,纯化产物中的DNA和Protein A残留极低,HCP残留结果相当,回收率稳定在90%以上。要说明的是,本实验由于无高盐洗杂过程,导致HCP结果略高,若采用高盐清洗可降低至400ppm,但三组实验所得HCP残留值基本相当。放大过程中柱高越高,去除DNA残留效果越好,同时ProteinA 泄露也更低。
 DNA、protein A、HCP残留、收率和纯度一览表
(1:Mab发酵上清,2:1ml柱洗脱液,3:8ml柱洗脱液,4:70ml柱洗脱液)
 
等保留时间超常规柱高条件下的规模放大理论计算
综上实验结果,通过维持保留时间不变,增加柱高至超常规柱高可获得良好的纯化效果和工艺稳定性,接下来对等保留时间下的超常规柱高规模放大做理论计算。
计算设计如下:
单抗样品:4 g/L的单抗发酵澄清液(200 L)
层析条件一:软胶Protein A填料,动态载量44mg/mL,BPG200柱高16 cm (5L),抗体上样量220g/次,分4亚批纯化。
层析条件二:UniMab填料,动态载量36mg/mL,BPG200柱高35cm (11L),抗体上样量400 g/次,分2亚批纯化。
 
 
通过上述计算可知,两组纯化工艺中的缓冲液用量相当,但相比传统的软胶Protein A填料,UniMab填料在超常规柱高条件下具有显著优势,批次耗时显著缩短(由9.5h缩短至4.5h),送检批次数减少50%,填料消耗利用减半,纯化抗体的生产效率提高1倍以上。
 
 
结论:
采用UniMab填料进行抗体纯化突破了传统“等柱高放大”的局限性,建立了更高效的”等保留时间放大”工艺路线平台,即在现有厂房设备基础上继续提升单批抗体的生产规模,增大生产效率,QC送检样品数量减半,节约QC资源投入。利用UniMab填料优势建立等保留时间规模放大,被证明是一种有效提升单抗药物产率的优化策略,可使下游成本大幅下降,为生物制药企业生产中国百姓用得起的抗体药物提供了一种优化选择。
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