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手性化合物色谱分析方法开发(二)

手性化合物色谱分析方法开发(二)

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  • 发布时间:2017-01-24 00:00
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【概要描述】任何形式的作用力均需要有相互作用的主客体,色谱法对手性化合物进行拆分的主体是手性色谱柱,客体当然是待拆分的化合物。手性色谱柱主要包括液相手性色谱柱以及气相手性色谱柱,下面主要介绍液相手性色谱柱。

手性化合物色谱分析方法开发(二)

【概要描述】任何形式的作用力均需要有相互作用的主客体,色谱法对手性化合物进行拆分的主体是手性色谱柱,客体当然是待拆分的化合物。手性色谱柱主要包括液相手性色谱柱以及气相手性色谱柱,下面主要介绍液相手性色谱柱。

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摘自:药渡

 

1、概述

任何形式的作用力均需要有相互作用的主客体,色谱法对手性化合物进行拆分的主体是手性色谱柱,客体当然是待拆分的化合物。手性色谱柱主要包括液相手性色谱柱以及气相手性色谱柱,下面主要介绍液相手性色谱柱。
 

液相手性色谱柱从其来源上可以分为天然产物及其修饰物以及聚合物两类,其中天然产物来源的手性色谱柱,主要有多糖(包括直连淀粉以及纤维素)衍生物类、寡糖如环糊精及其衍生物类(主要应用的是β以及γ型环糊精)、糖蛋白类、大环内酯抗生素类以及冠醚类,此外还有一些特殊用途的专用离子手性色谱柱。其中多糖及其衍生物类型的手性色谱柱属于通用型的手性色谱柱,同时也是目前应用最多,品类最广泛的手性色谱柱。

 

2、多糖衍生物类手性色谱柱

多糖衍生物类手性色谱柱最早应用于手性化合物的色谱分析,作为手性拆分通用型的色谱柱,据统计80-95%(统计数据来源覆盖范围不同,不同的领域内存在差异,不可过分迷信)的化合物,可以通过使用多糖衍生物类手性色谱柱配合方法开发策略实现成功拆分。根据其发展的历史以及选择性配体-多糖衍生物与色谱柱基质,多孔硅胶的结合方式的不同,可以进一步分为涂覆型手性色谱柱以及键合型的手性柱。

 

2.1、涂覆型多糖衍生物类手性色谱柱

涂覆型的多糖衍生物手性色谱柱,可以归属于第一代多糖类手性色谱柱,种类有很多(其中Daicel的种类最全,以其为例),但其基本的组成包括色谱柱硅胶基质以及多糖衍生物。不同点在于多糖类型的不同以及衍生物的选择性配体的差异,如下图1-1以及1-2所示。

 

Fig.1-1 Structure difference between amylose and cellulose derivative

 

Fig.1-2 Chiral selective ligands used for polysaccharide columns

 

直链淀粉与纤维素在单糖单元上,基本无差异,区别在于其三维结构上,直链淀粉的螺旋比纤维素要更大、更规律以及更为刚性。如图1-2所示,是几种不同形式的多糖衍生物选择性配体。

 

常用到的涂覆型的手性色谱柱有AD-H,AS-H直链淀粉型手性色谱柱,OD-H,OJ-H纤维素型手性色谱柱,其配体结构如下图2所示。其中OD-H与AD-H的的选择性配体均为3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯,二者对手性化合物的选择性差异主要在于基质多糖之间。

 

Fig.2 Chiral selective ligands used for coated columns of Daicel

 

涂覆型的多糖衍生物手性色谱柱由于是先将多糖衍生物溶解,如使用THF溶解,然后将其均匀涂覆在多孔硅胶基质之上。因此,对流动相的种类有着严格的要求,即不可使用可将手性涂覆层洗脱下来的溶剂,如丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯以及四氢呋喃等,即使很少量的此类溶剂也会对该类型的手性色谱柱带来不可逆转的损害。

 

该类手性色谱柱的典型使用环境为烷烃类溶剂为主,搭配一定比例的醇类溶剂,如乙醇、异丙醇、正丁醇等。分析酸碱等极性化合物的时候,添加一定比例的有机酸碱添加剂。此外,也可以使用极性洗脱模式,即使用100%的有机醇类或者乙腈及其混合物作为流动相,但不可使用反相洗脱模式。

 

反相洗脱模式可以使用另外的一种类型的涂覆型手性色谱柱,包括AD-RH,OD-RH,OJ-RH,AS-RH等,这几款手性色谱柱的多糖衍生物的类型以及选择性配体均与-H型的色谱柱一致,区别在于其可以用于反相洗脱模式(所用的硅胶类型的差异),这无疑扩大了多糖衍生物类手性色谱柱的应用范围,如含有较大的疏水基团的手性化合物的拆分。

 

2.2、键合型多糖衍生物类手性色谱柱

正如前面所说的,涂覆型的手性色谱柱在使用的时候,对流动相的种类要求比较严格,只能够使用标准流动相,无形中对流动相对手性化合物的选择性打了较大的折扣。而键合型手性色谱柱,第二代多糖衍生物类手性色谱柱,则通过多衍生物与色谱柱固定相硅胶基质之间化学键合,从而提高了对于非标准流动相的耐受能力,一举将多糖衍生物类手性色谱柱的溶剂使用范围扩大到没有溶剂限制的程度。这使得,在发挥色谱柱的选择性的同时,又能够充分发挥流动相的手性选择性。

 

常见到的键合型手性色谱柱有IA、IB、IC、ID、IE、IF以及最新的IG其相应的配体结构如下图3所示。其中IB以及IC为纤维素型多糖衍生物,其余均为直链淀粉型多糖衍生物。

 

Fig.3 Chiral ligands for immobilized columns of Daicel

 

从上图3中,我们可以看到其选择性配体与涂覆型手性色谱柱的选择性配体之间存在有交叉,但也有不同,如3,5-二氯苯基氨基甲酸酯以及3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯类型的手性配体是涂覆型手性色谱柱中所没有的种类。原因在于3,5-二氯苯基氨基甲酸酯类的手性配体,经涂覆在硅胶基质上之后的稳定性很差,即使是使用典型的标准正相流动相,在几个运行之后也会变得很差。

 

一般地,键合型多糖衍生物手性色谱柱,在同样的衍生物选择性配体的基础上,可以部分甚至完全取代涂覆型的手性色谱柱,如下图4所示,但也不排除例外的情形,且这种例外情形多与“涂覆”有关。

 

Fig.4 Separation comparison between IB and OD-H chiral column of Daicel

 

从上图4中,我们可以看到在使用IB手性色谱柱的时候,选择性因子α要比OD-H下大,且柱效也明显高得多,色谱峰的对称型也更好。

 

相比涂覆型的多糖衍生物类手性色谱柱,键合型多糖手性色谱柱可以使用各种非标准型溶剂作为流动相,包括涂覆型色谱柱所禁止使用的流动相,如二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等,如下图5-1以及图5-2所示。使用I系列的键合型手性色谱柱配合使用这些非标准流动相,实现了对手性化合物的完美分离。

 

Fig.5-1 Solvent versatility of immobilized columns

 

Fig.5-2 Solvent versatility of immobilized columns

 

与涂覆型多糖手性色谱柱一样,I系列的手性色谱柱亦可使用极性洗脱模式,不同的是I系列还可使用反相模式。

 

多糖类手性色谱柱对手性化合物进行拆分的时候,可能存在有π-π相互作用、氢键作用、偶极作用以及包含等作用,如下图6所示。

 

Fig.6 Interaction between analyte and chiral polysaccharide columns

 

2.3、环糊精类色谱柱

环糊精及其衍生物类型的手性色谱柱,无论气相或者液相均主要是指β或者γ环糊精,其中β型环糊精如下图7所示。

 

Fig.7 Structure characteristic of β-cyclodextrin

 

气相色谱与液相色谱用的环糊精手性色谱柱的配体不同,其中下图8所示是几种比较常见的配体,其中前三种气相较多,而后三种则液相较多。

 

Fig.8 Common ligands for cyclodextrin derivative chiral columns

 

环糊精及其衍生物类手性色谱柱,在对手性化合物进行拆分的时候,其主要的作用力的类型包括表面处的氢键相互作用,以及环糊精腔体内的包含以及静电相互作用,如下图9所示。

 

Fig.9 Possible interaction under cyclodextrin for chiralrecognition

 

常见的液相环糊精及其衍生物手性色谱柱包括,Cyclobond系列:Cyclobond I 2000、Cyclobond I 2000 AC、Cyclobond I 2000 DM、Cyclobond II、Cyclobond II AC等;以及资生堂的一根CD-Ph反相手性色谱柱。

 

2.4、其他手性色谱柱

其他类型的手性色谱柱有很多,包括大环内酯类抗生素手性色谱柱,其中一款色谱柱的手性固定相以及可能发生的手性作用位点以及作用力的类型,如下图10所示。其中就包括离子化相互作用位点,氢键的给受体作用位点,π-π相互作用位点,以及A、B、C三个手性选择性腔体的包含以及静电相互作用等。

 

Fig.10 Possible interaction and sites for a macrolide chiralcolumn

 

Pirkle型手性色谱柱是π-π相互作用的代表,如下图11A所示3,5-二硝基苯基为π-酸结构,而11B所示则是π-酸与π-碱结构的共同体。该类型的手性色谱柱比较适合与分离含有苯环或者其他杂环类型的手性化合物。

 

Fig.11 Two kinds of classic prikle columns

 

蛋白质类手性色谱柱主要有HSA、TAG、CBH型。其中TAG的适用范围较广,HSA适用于强酸性化合物,CBH适用于强碱性化合物。其对手性化合物的拆分机理,除了氢键相互作用,离子化相互作用之外,更加类似与“锁-钥匙”模型,如下图12所示,一般蛋白质类型的手性色谱柱只用做反相模式。

 

Fig.12 The interaction between analyte and protein column

 

3、结论

一般地,在使用液相色谱对于手性化合物进行拆分的时候,手性色谱柱的选择性优先级>流动相的选择性的优先级>操作条件如流速,温度等的优先级。而我们常用到的手性色谱柱中,多糖衍生物类手性色谱柱属于最通用型的手性色谱柱,包括涂覆型以及键合型。其中键合型多糖手性色谱柱的溶剂适用性最广,而且其允许的洗脱模式最全,可以部分甚至完全地取代涂覆型的手性色谱柱。此外,还有另外一些种类的手性色谱柱,包括环糊精及其衍生物类手性色谱柱,蛋白质类手性色谱柱以及大环内酯抗生素类手性色谱柱等。

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