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以成熟的单抗纯化为参照,讨论个性化的疫苗纯化

以成熟的单抗纯化为参照,讨论个性化的疫苗纯化

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  • 来源:
  • 发布时间:2017-04-20 00:00
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【概要描述】离心、层析和过滤这三大基本技术在生物制品的纯化中已经得到了较为广泛的应用,不仅设计原理规范,设备选型也算成熟。

以成熟的单抗纯化为参照,讨论个性化的疫苗纯化

【概要描述】离心、层析和过滤这三大基本技术在生物制品的纯化中已经得到了较为广泛的应用,不仅设计原理规范,设备选型也算成熟。

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摘自:生物咖啡茶,作者:杨于京博士

离心、层析和过滤这三大基本技术在生物制品的纯化中已经得到了较为广泛的应用,不仅设计原理规范,设备选型也算成熟。不过,这些知识与经验大多都是与单克隆抗体(单抗)的分离纯化相关;疫苗(包括人用疫苗和动物疫苗)纯化则不然,可说的不多、能说的有限。一直以来,疫苗的纯化通常就是简单的离心分离、过滤除菌,尤其动物疫苗采用超滤、层析纯化的很少。但是,由于疫苗厂家越来越注重产品质量、提高效价、减少副反应,同时随着上游全悬浮细胞培养的推广和精品疫苗、重组疫苗、VLPs疫苗的出现,对疫苗纯化的要求也越来越高。

 

与特性单一、结构相近的单抗不同,疫苗的种类繁多。病毒苗、多糖苗、核酸苗、蛋白苗以及近年来颇受青睐的VLPs苗,这些特性不同、型态各异的疫苗给下游纯化带来了相当大的挑战。疫苗纯化,不仅在工艺流程的规划和设计上无章可循,在工艺单元的方法取舍和设备选型上也缺少前车之鉴。因而,目前疫苗纯化的工艺开发多需要因苗而异、区别对待。

 

 

相对而言,目前单抗的纯化工艺已很成熟,到了类似于八股文“起承转合”的标准模式。单抗纯化自“固液分离”(clarification)始,经“捕获”(capturing)、“初纯”(purification)、“精纯”(polishing)、“病毒去除”(virus clearance)、“超滤浓缩”(final concentration)、至“除菌过滤”(sterile filtration)止。疫苗纯化则反之,不仅工艺流程总是“别有洞天”,在设备选型和确定参数时还常常会出现“刘姥姥进大观园”似的惊喜。

 

不过,以较为成熟的单抗纯化工艺为参照,可能有益于分析和探究疫苗的纯化。

 

生物制品纯化的第一步通常是“固液分离”(clarification)。由于单抗生产一般采用CHO细胞(即使选用其它动物细胞、其发酵液中的细胞浓度和活性也相差不多),而其目标产物(单克隆抗体)也都是在培养液中,所以,单抗纯化的“固液分离”简单直接一般首选大型连续流离心机。大型连续流离心机固然有线性放大不易、设备造价高昂的问题,但其运行操作简单、分离效果稳定。单抗纯化“固液分离”的发酵稳定、运行简单,选用大型连续流心机能够扬长避短。而疫苗纯化的“固液分离”则全然不同,疫苗生产可能采用动物细胞、酵母,也可能采用细菌发酵;而其目标产物(疫苗)可能是胞内或是莢膜,也可能是胞外、在培养液中;疫苗纯化的“固液分离”可能要分为几步,无法一步完成。例如大肠杆菌发酵生产重组蛋白疫苗则一般要经过“菌体收集”、“细胞破碎”、“包涵体溶解”、“蛋白/细胞碎片分离”等一系列工艺步骤,才能完成“固液分离”,远比单抗的“固液分离”复杂艰辛。正是由于疫苗纯化“固液分离”的变化多、步骤多,疫苗纯化的固液分离的设备选型更需要扬长避短、权衡利弊。同时,由于疫苗纯化“固液分离”中细胞破碎的方法和细胞破碎的条件也会对后续的分离结果带来极大的影响,所以,疫苗纯化“固液分离”的流程设计、设备选型和运行参数的选择和确定需要考虑的因素就更多、无法一蹴而就。

 

 

生物制品纯化的第二步通常是“捕获”(capture)。由于单抗结构相近,都有共同的Fc端,所以,不同单抗纯化的“捕获”都可以采用最有效的亲和层析,Protein A柱层析。不言而喻,Protein A的发现和使用是单抗纯化“捕获”工艺单元成功的关键。采用Protein A柱层析,不仅捕获的单抗纯度高,Protein A的载量也不低,从而使得单抗捕获单元的生产效率也高。随着Protein A层析胶的改进,更便于清洗、寿命更长,使用Protein A的高效益摊薄了采购Protein A的高成本,促使单抗纯化“捕获”工艺单元的成熟。疫苗的“捕获”与单抗不同,疫苗的多样性造成了疫苗“捕获”工艺单元的复杂性。疫苗捕获没有简单、统一、高效的捕获方法。以目前市场现有的产品而言,离子交换通常载量较高、但选择性一般较低;亲和层析虽然选择性较高、但其载量通常又较低。膜层析(和完整柱)捕获病毒、核酸类疫苗效果虽然较好,但其单柱体积又较小。疫苗捕获,要找到一种高效、经济、适用的方法,还真是“革命尚未成功,同志们仍需努力”。

 

 

生物制品纯化通常通过“初纯”(purification)和“精纯”(polishing)来进一步提高产品纯度、减少杂质含量。经过多年的比较和鉴别,单抗纯化通常会采用离子交换层析来完成“初纯”和“精纯”。近年来,将“初纯”和“精纯”合二为一的复合层析介质以及为提高“精纯”效率的膜层析都是对单抗纯化的精益求精的技术改进,提高了单抗纯化的生产效率、降低了生产成本。疫苗纯化的“初纯”和“精纯”则还处于萌芽阶段,是否需要、如何使用还在初步尝试阶段。客观评述,疫苗产品对产品纯度的要求与对产品中杂质含量的控制近乎苛刻的单抗有所不同,当前疫苗纯化的主要目标还是降低副作用、提高效价。因此,疫苗的纯化要求和杂质控制需要进一步探讨,以制定切实可行的质量标准。

 

生物制品纯化必须包括“病毒去除”和“除菌过滤”,通常也需要“超滤浓缩”。单抗纯化中这几个工艺单元已很成熟,超滤除病毒、微滤除菌和膜包浓缩已是定论。反观疫苗纯化,这些纯化工艺单元却都还面临不同的挑战。

 

 

除了以上生物制品纯化主要工艺单元,疫苗纯化还有以下几个重要主题值得关注。

 

中空纤维:

尽管离心与过滤都是生物制品纯化“固液分离”时常用的技术,而离心通常要比过滤操作更简便、效果更稳定;但是,中空纤维却通常比离心机使用更灵活、成本更低。特别是如果疫苗纯化“固液分离”阶段需要包括细胞破碎,其工艺流程则包括(细胞)收集、(悬浮)洗涤、(细胞)破碎、(蛋白变性)溶解、(细胞碎片/溶解蛋白)分离等几步。尽管离心机的“分离”优势明显,但其在包括细胞破碎等多步“固液分离”工艺中的连续性则较差。相对而言,中空纤维却长于使用灵活,可在收集、洗涤、破碎、溶解、分离等数个步骤中灵活使用。不同规模的连续流离心机差别明显,线性放大不易;中空纤维不然,“线性放大”已成体系;这对于没有多少前车之鉴的疫苗纯化更有利。当然,也不能忽视中空纤维工艺开发困难、运行控制繁琐、对样品变化适应性较差的问题。疫苗产品的特点和疫苗生产的条件是决定选用离心还是中空纤维的关键。

 

 

蛋白复性:

重组蛋白疫苗的纯化工艺一般都会包括蛋白变性、复性这一过程。虽然包涵体溶解(蛋白变性)方法成熟,蛋白复性则不然。传统实验室常用的“透析”方法无法适应大规模疫苗生产的需要,采用柱上复性、超滤复性等不同方法的蛋白复性效率常常困扰着疫苗的工艺开发。蛋白复性与蛋白本身关系很大,有些蛋白容易复性,无论是柱上还是超滤,复性快、效率高;但多数蛋白则复性困难,稍有不慎则蛋白活力尽失。蛋白复性成败的关键多在于对蛋白复性关键期的控制,选择适合控制蛋白复性关键期的条件可以提高蛋白复性的效率。

 

吸附洗脱:

生物制品纯化中目标产物的吸附洗脱通常是通过层析柱完成。与典型单抗纯化吸附洗脱相比,疫苗的吸附洗脱通常卡在层析介质对疫苗吸附时的“量”和洗脱时的“质”。现代层析介质大多是随着单抗市场的发展而成长,而由于病毒苗、基因苗等与单抗分子的尺寸差别很大,所以,现有层析介质对病毒核酸类疫苗的载量通常较低。介质吸附量低通常导致捕获层析柱的柱体积过大、给实际生产带来难以实施的困难。同时,疫苗在洗脱后效价大幅降低的情况并不鲜见。保持疫苗洗脱后的生物活性是疫苗纯化中不可忽视的问题。

 

亲和层析:

Ni胶是用于纯化带有识别标记的重组蛋白的利器,但选用Ni胶需要慎重。除了载量、价格,重金属Ni脱落后的去除是疫苗纯化需要考虑的安全问题。尽管Protein A也会脱落,但在单抗纯化工艺中,Protein A可以被随后的阳离子交换有效去除;而Ni脱落的去除工艺还未成熟。再者,Ni胶的载量和成本也还不那么尽人意。

 

超滤浓缩:

生物制品纯化的产品浓缩多会采用超滤完成,但单抗纯化常用的膜包却不一定适用于疫苗浓缩。大多数单抗适应性强,实践中很少遇到经超滤浓缩、蛋白失活的情形。而疫苗则不然,不仅流速,超滤膜材和网栅都有可能影响疫苗的活性和效价。疫苗的超滤浓缩应尽量选用亲水性膜材、无网栅的超滤器。需要警惕超滤浓缩工艺至使疫苗变性、效价降低的情况。

 

内毒素去除也是疫苗纯化常常面临的挑战,应对方法也只能是具体问题、具体分析解决,没有一个简单易行的定式。

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